|
|
PCR v reálném čase a její využití v potravinářství
Tomanová, Barbora ; Pravečková, Martina (oponent) ; Trachtová, Štěpánka (vedoucí práce)
Polymerázová řetězová reakce (PCR) je hojně využívaná molekulárně diagnostická metoda. PCR v reálném čase neboli kvantitativní PCR (qPCR) je jednou z jejích modifikací, které díky svým výhodám nachází v současnosti stále širší využití. Uplatňuje se mimo jiné v potravinářství při poměrně přesné detekci, identifikaci a kvantifikaci žádoucích i nežádoucích složek potravin, což s sebou mnohdy přináší značné obtíže a vede intenzivnímu vývoji této metody. V experimentální části byla izolována DNA z mléčného výrobku Bio Via Natur drink pro její další zpracování pomocí PCR a zisk podrobnějších informací o bakteriálním složení pomocí PCR v reálném čase a HRM analýzy.
|
|
|
Využití metody PCR-HRM analýzy pro identifikaci bakterií v potravinách a doplňcích stravy
Šurková, Alice ; Illková, Kateřina (oponent) ; Trachtová, Štěpánka (vedoucí práce)
Teoretická část práce se věnuje potravinám a potravinovým doplňkům s obsahem mikroorganismů, především bakterií. Dále pojednává o metodách identifikace těchto bakterií, především o polymerázové řetězové reakci (PCR). Zahrnuje také PCR v reálném čase a zvláštní pozornost je věnována vysokorozlišovací analýze křivky tání (HRM). V experimentální části byla z vybraného probiotického výrobku izolována DNA pomocí magnetických mikročástic. Byla stanovena její koncentrace a dále byla podrobena PCR s následnou detekcí agarózovou gelovou elektroforézou. Pro upřesnění výsledků byla provedena také HRM analýza.
|
|
|
Optimalizace izolace DNA jogurtových kultur a její detekce pomocí RT-PCR
Šurková, Alice ; Němcová, Andrea (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
V rámci práce byla optimalizována izolace DNA z čistých jogurtových kultur i z jogurtových výrobků. Izolovaná DNA byla následně podrobena analýze pomocí RT-PCR. V první části práce byla vyhodnocena izolace DNA z čistých jogurtových kultur pomocí komerčního kitu jako efektivnější než izolace fenolovou extrakcí a pomocí magnetických mikročástic. K posouzení kvality a kvantity získané DNA bylo použito spektrofotometrické stanovení koncentrace a čistoty a qPCR. Pomocí komerčního kitu pak byla získána DNA v kvalitě vhodné pro PCR celkem z deseti čistých jogurtových kultur. V druhé části práce byla provedena izolace bakteriální DNA z jogurtových výrobků pomocí komerčního kitu s předchozím promytím vzorků lyzačním roztokem. Takto byla DNA izolována ze šesti jogurtových výrobků. Dále byly z těchto výrobků zaočkováním do mléka vyrobeny dvě várky domácích jogurtů, z nichž byla izolována DNA stejným způsobem. DNA získaná z jogurtů byla podrobena RT-PCR se šesti dvojicemi primerů (V3_F a V3_R, V6_F a V6_R, V1_F a V1_R, GroHRM_F a GroHRM_R, UPF a UPR, P1V1 a P2V1) a s DNA z čistých kultur jako pozitivními kontrolami. Z výsledků byla potvrzena přítomnost deklarovaných kultur v jednotlivých jogurtech a jejich schopnost množit se i po zaočkování do nového média (mléka).
|
|
|
Digital PCR development
Gaňová, Martina ; Lipov,, Jan (oponent) ; Jansová,, Eva (oponent) ; Neužil, Pavel (vedoucí práce)
In recent years, microtechnological and nanotechnological methods have proven to be a powerful analytical tools for deoxyribonucleic acid (DNA) analysis. There are reviewed different techniques developed over the last decade to amplify the nucleic acids (NA), including microfluidic systems. Polymerase chain reaction (PCR) is widely used in molecular biology to amplify target NA in vitro. The number of groups working on PCR worldwide is significant given the substantial social and economic impact of this technique, for example, in medical diagnostic, criminology, food processing, or environmental studies. Nowadays, the coronavirus disease 2019 pandemic proved the importance of developing more accessible technologies for diagnosing viral diseases. The thesis presents the development of two versions of PCR platforms for NA detection, droplet real-time quantitative PCR (qPCR) and digital PCR (dPCR). The critical components of both platforms were fabricated using the microtechnological procedures for surfaces modification and lithographic fabrication, allowing the development of hydrophobic cover glasses or silicon microchips. The results of the thesis demonstrate the design, assembly, and testing with optimization of both platforms. The PCR technology consists of a software part controlled by the LabView program and a hardware part consisting of a temperature control system and a fluorescence imaging system. The droplet qPCR was conducted in 0.3 µL of the master mix droplet containing the target gene encapsulated with 2 µL of mineral oil. The droplets were pipetted on the hydrophobic cover glass, placed on the thermoelectric cooler (TEC) under the fluorescence microscope to conduct thermal cycling. The fluorescence changes during thermal cycling were captured by photomultiplier tubes and monitored by oscilloscope. The results of the testing also present the multiplexing capability of the developed technique. Three synthetic genes using intercalating fluorescent dye for simultaneous detection and quantification based on a single fluorescence channel were introduced. The droplet qPCR technology was a crucial platform for further development of the dPCR platform. The dPCR platform employed a silicon microchip with microwell sample dispersion to the 26 448 microwells, each with a target diameter of 50 µm and a volume of 59 pL. The microchip loaded with the master mix containing the target DNA was covered by the mineral oil and cover glass modified by polydimethylsiloxane and Parylene C. The heating/cooling system of thermal cycling with the TEC was similar to the droplet qPCR platform. The fluorescent imaging system used a complementary metal-oxide-semiconductor (known as CMOS) camera to capture the fluorescent images. The developed dPCR was demonstrated for applications in human medical research. The synthetic virus DNA, isolated virus DNA, and female genomic DNA were tested. The thesis reveals the development of the dPCR system, which is a part of a new dPCR technique that is more affordable, easy to use with simple sample delivery, which are the most common problems why it has not yet found much popularity among laboratories. The silicon-based microchip dPCR improved the system performance due to a large number of wells. The employment of such dPCR benefits of high sensitivity, low signal to noise ratio, accuracy or lower detection limit, and multiplexing capability.
|
|
|
Studium využití uracil-DNA glykosylasy s cílem zamezit kontaminací testovaných vzorků produkty předchozích DNA amplifikačních reakcí
Zrnová, Adéla ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Prošková, Veronika (oponent)
Amplifikace DNA je velmi důležitý nástroj diagnostiky infekčních nemocí. Nejběžněji používanou metodou v laboratořích je polymerázová řetězová reakce, která však nesplňuje potřebu rychlé a vybavením nenáročné metody. Bylo tedy nutné vyvinout metodu, která bude citlivá, rychlá, specifická a dostupná i například pro rozvojové země s omezeným přístupem k přístrojovému vybavení. Zdá se, že touto metodou by mohla být LAMP. Metoda LAMP se bohužel setkává se značnou falešnou pozitivitou, které je třeba zabránit, aby ji bylo možné využít v praxi. Předmětem předkládané bakalářské práce je zavedení unikátní LAMP metody detekce přítomnosti DNA Streptococcus pneumoniae a dále studium využití uracil-DNA glykosylasy k zamezení kontaminace vzorků pomocí DNA vzniklé v předchozích amplifikačních reakcích. LAMP metoda detekce DNA Streptococcus pneumoniae byla úspěšně zavedena, poté byla metoda optimalizována i v přítomnosti deoxyuridintrifosfátu. Po zjištění vhodné koncentrace deoxyuridintrifosfátu pro LAMP amplifikaci, byly takto vzniklé produkty amplifikace DNA Streptococcus pneumoniae ošetřeny pomocí uracil-DNA glykosylasy. Bylo prokázáno, že tento postup má potenciál zamezit falešné pozitivitě dalších amplifikačních reakcí pro detekci DNA Streptococcus pneumoniae v laboratoři. Klíčová slova: polymerázová...
|
|
|
Optimalizace izolace DNA jogurtových kultur a její detekce pomocí RT-PCR
Šurková, Alice ; Němcová, Andrea (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
V rámci práce byla optimalizována izolace DNA z čistých jogurtových kultur i z jogurtových výrobků. Izolovaná DNA byla následně podrobena analýze pomocí RT-PCR. V první části práce byla vyhodnocena izolace DNA z čistých jogurtových kultur pomocí komerčního kitu jako efektivnější než izolace fenolovou extrakcí a pomocí magnetických mikročástic. K posouzení kvality a kvantity získané DNA bylo použito spektrofotometrické stanovení koncentrace a čistoty a qPCR. Pomocí komerčního kitu pak byla získána DNA v kvalitě vhodné pro PCR celkem z deseti čistých jogurtových kultur. V druhé části práce byla provedena izolace bakteriální DNA z jogurtových výrobků pomocí komerčního kitu s předchozím promytím vzorků lyzačním roztokem. Takto byla DNA izolována ze šesti jogurtových výrobků. Dále byly z těchto výrobků zaočkováním do mléka vyrobeny dvě várky domácích jogurtů, z nichž byla izolována DNA stejným způsobem. DNA získaná z jogurtů byla podrobena RT-PCR se šesti dvojicemi primerů (V3_F a V3_R, V6_F a V6_R, V1_F a V1_R, GroHRM_F a GroHRM_R, UPF a UPR, P1V1 a P2V1) a s DNA z čistých kultur jako pozitivními kontrolami. Z výsledků byla potvrzena přítomnost deklarovaných kultur v jednotlivých jogurtech a jejich schopnost množit se i po zaočkování do nového média (mléka).
|
|
|
Využití metod PCR ve forenzní genetické analýze.
Dvořáková, Lenka ; Šimková, Halina (vedoucí práce) ; Vaněk, Daniel (oponent)
Polymerase Chain Reaction neboli PCR je molekulárně genetická metoda sloužící k amplifikaci daného fragmentu DNA. V dnešní době je to jedna z nejpoužívanějších a nejúspěšnějších molekulárně genetických metod, která se využívá v mnoha vědeckých i aplikovaných oborech. PCR má mnoho modifikací odvozených od klasického schématu reakce - například multiplex PCR, inverzní PCR, nested PCR, asymetrická PCR a plno dalších. Ve forenzní genetické analýze se PCR využívá především jako metoda amplifikace studovaných lokusů při fragmentové analýze, jako součást sekvenace a dále pak v kvantifikaci jako real-time PCR. Cílem této práce je shrnout využití polymerázové řetězové reakce ve forenzní praxi a nastínit metody, při kterých se PCR používá.
|
|
|
Využití metody PCR-HRM analýzy pro identifikaci bakterií v potravinách a doplňcích stravy
Šurková, Alice ; Illková, Kateřina (oponent) ; Trachtová, Štěpánka (vedoucí práce)
Teoretická část práce se věnuje potravinám a potravinovým doplňkům s obsahem mikroorganismů, především bakterií. Dále pojednává o metodách identifikace těchto bakterií, především o polymerázové řetězové reakci (PCR). Zahrnuje také PCR v reálném čase a zvláštní pozornost je věnována vysokorozlišovací analýze křivky tání (HRM). V experimentální části byla z vybraného probiotického výrobku izolována DNA pomocí magnetických mikročástic. Byla stanovena její koncentrace a dále byla podrobena PCR s následnou detekcí agarózovou gelovou elektroforézou. Pro upřesnění výsledků byla provedena také HRM analýza.
|
|
|
PCR v reálném čase a její využití v potravinářství
Tomanová, Barbora ; Pravečková, Martina (oponent) ; Trachtová, Štěpánka (vedoucí práce)
Polymerázová řetězová reakce (PCR) je hojně využívaná molekulárně diagnostická metoda. PCR v reálném čase neboli kvantitativní PCR (qPCR) je jednou z jejích modifikací, které díky svým výhodám nachází v současnosti stále širší využití. Uplatňuje se mimo jiné v potravinářství při poměrně přesné detekci, identifikaci a kvantifikaci žádoucích i nežádoucích složek potravin, což s sebou mnohdy přináší značné obtíže a vede intenzivnímu vývoji této metody. V experimentální části byla izolována DNA z mléčného výrobku Bio Via Natur drink pro její další zpracování pomocí PCR a zisk podrobnějších informací o bakteriálním složení pomocí PCR v reálném čase a HRM analýzy.
|
|
|
Optimalizace parametrů polymerázové řetězové reakce.
VOJTOVÁ, Magda
Abstrakt Polymerase Chain Reaction (PCR) je molekulárně biologická metoda, jejímž cílem je namnožení neboli amplifikace požadovaného úseku DNA. Jedná se o velice citlivou a specifickou techniku. Nově vzniklé modifikace pracující na principu PCR techniky jsou nepostradatelné především pro diagnostiku některých virových, bakteriálních, nádorových, ale i geneticky podmíněných onemocnění. Cílem mé bakalářské práce je, pochopit celý systém této techniky, popsat její jednotlivé složky, postup a princip. Hlavním úkolem mé práce bylo optimalizovat metodu tak, aby její specifičnost, přesnost a její výtěžek byl co nejvyšší a dostačující k dalšímu výzkumu a analýze. Všechny optimalizační kroky byly prováděny při amplifikaci cDNA (Spinacia oleracea) pro geny kódující proteiny PsbR a PsbQ z fotosystému II vyšších rostlin, sloužící zejména pro výzkum fotosyntézy. Díky poznatkům získaným během jednotlivých optimalizačních experimentů je možné odpovědět, které kroky jsou pro správnou amplifikaci genů fotosyntetických proteinů přínosné a kterým je nutné se vyhnout. Amplifikace proteinu PsbQ byla zaměřena na optimalizaci chemickými vlivy, naopak amplifikace proteinu PsbR byla optimalizována vlivy fyzikálními. Cílové faktory sloužící pro zlepšení výtěžnosti PCR produktu spočívaly v případě chemických vlivů v rozdílných koncentracích jednotlivých základních složek reakční směsi, tedy výchozí DNA, Taq DNA polymerázy, dNTP, primerech a hořečnatých iontech. Navyšování výtěžku amplifikace fyzikálními vlivy bylo zaměřeno především na optimalizaci počtu cyklů, nastavení správné teploty annealingu a času extenze. V praktické části bakalářské práce uvádím celou sérii výsledných gelů s jasným závěrem, které podmínky pro amplifikaci produktů byly nejvhodnější a které naopak přinášejí amplifikaci problémy. Správně nastavená metoda byla analyzována elektroforeticky, a to sledováním ostrosti odpovídajícího pásma a vzniku falešně negativních či falešně pozitivních výsledků. Pro minimalizaci nežádoucích produktů byly experimentálně ustanoveny pro amplifikaci proteinu PsbQ za nejvhodnější následující parametry: nejnižší koncentrace DNA a to 0,01 ?g/?l, pro Taq DNA polymerázu výsledná aktivita 0,05 U/?l. Vyšší hodnoty obou složek přinášejí při amplifikaci vznik sekundárních produktů omezujících dostatečný výtěžek reakce. Nutnost optimalizace pro amplifikaci každého genu potvrzuje vyhledání správné koncentrace dNTP. Jako nejoptimálnější koncentrace byla zvolena 0,2 mM, jen jednou tak vysoká hladina je již pro reakci inhibiční. Koncentrace použitých primerů se jevily jako přímo úměrné, tzn. čím vyšší hladiny v rozmezí 0,1-2 ?M byly použity, tím bylo ve sledované oblasti 446 bp dosaženo vyššího výtěžku výsledného produktu. Studie zaměřené na ustanovení správné koncentrace hořečnatých iontů upozorňují na nižší hladiny než 1,5 mM, které působí na reakci maximálně inhibičně, všechny vyšší hladiny garantují kvalitní výtěžek amplifikace. Stejného závěru bylo docíleno i v případě amplifikace genu PsbQ. Rovněž i principy optimalizace PCR fyzikálními vlivy a to proteinu PsbR se opíraly o poznatky získané z vědecké literatury zaměřené na tuto problematiku. Ideální teplota annealingu byla 63° C, jednoznačné zesílení amplifikace pak přineslo navyšování počtu cyklů. Teprve až 30 proběhlých cyklů PCR reakce zaručuje ve sledované oblasti 290 bp vznik silného bandu. Kvalitní amplifikaci pak také zajišťuje 2 minuty dlouhá extenze, kratší doba zaručuje zisk žádného nebo jen nízkého výtěžku. Všechny optimalizované parametry byly využity pro analýzu několika neznámých vzorků, v kterých se měla zjistit přítomnost popsaných genů ? PsbR, PsbQ a tím potvrdit správnost optimalizace PCR techniky pro zkoumané geny. Výsledky optimalizace budou použity jako výchozí protokol v laboratoři pro amplifikaci obou genů.
|
host ::
RSS.